Увлеченный своими исследованиями, Павлов очень мало думал о материальном благополучии и до женитьбы не обращал на житейские проблемы никакого внимания. Бедность начала угнетать его только после того, как в 1881 г. он женился на Серафиме Васильевне Карчевской. Деньги на их свадьбу дали родственники жены. Следующие десять лет Павловы прожили очень стесненно. Младший брат Ивана Петровича, Дмитрий, работавший ассистентом у Менделеева и имевший казенную квартиру, пустил молодоженов к себе.
Позже Серафима Васильевна вспоминала: «Когда после дачного житья мы вернулись в Петербург, у нас не оказалось совершенно никаких денег. И если бы не квартира Дмитрия Петровича, то буквально некуда было бы преклонить голову». Недоставало денег, чтобы «купить мебель, кухонную, столовую и чайную посуду и белье для Ивана Петровича, так как у него не было даже летней рубашки». Первый ребенок Павловых, Мирчик, умер. Чтобы обеспечить семью, Иван Петрович был принужден прибегать к побочным заработкам. Одно время он даже преподавал в школе для фельдшериц. Часто с таким трудом заработанные деньги ему приходилось тратить на покупку подопытных животных. Материальное положение поправилось только в 1890 г., когда Иван Петрович был избран профессором фармакологии Военно-медицинской академии (в 1895 г. он перешел в той же академии на кафедру физиологии и руководил ею в течение 30 последующих лет). Одновременно в 1891 г. Павлов начал работать в институте экспериментальной медицины, где возглавил отдел физиологии.
Всемирную известность Павлову принесли его работы в области физиологии пищеварения. Исследователи предшествующей эпохи потратили много усилий, стараясь разгадать секреты функционирования пищеварительного тракта, но успехи их были достаточно скромными. Было очевидно, что органы пищеварения представляют собой настоящую лабораторию, и пища, попадая в рот, желудок и кишечник, подвергается там сложной химической обработке, однако детали этого процесса оставались совершенно непонятны. Не ясно было, от чего зависит выделение желез, все ли они выделяют пищеварительные соки на всякую еду или каждая предназначена для переваривания особого продукта, зависит ли интенсивность отделения этих соков-секретов от количества поглощенной пищи, дополняют ли эти реактивы друг друга или, напротив, нейтрализуют, и, наконец, в какой мере зависят все эти процессы от нервной системы? Вовсе не было известно, какие причины способствуют выделению желудочного и кишечного сока. Не были изучены механизмы продвижения пищи в кишечнике и степень участия различных его отделов в усвоении этих продуктов. Не лучше обстояло дело с попытками исследовать деятельность желез желудка. Исследователи пользовались грубой методикой наблюдения, заключавшейся в том, что в желудке подопытной собаки делали фистулу (искусственный канал), вставляли в него трубку и исследовали вытекавший наружу сок. Однако, смешанный с пищей, он представлял мало интереса для науки. Чтобы изучить свойства пищеварительного сока, приходилось делать настой из слизистой оболочки желудка животного.
Павлову выпала честь вывести физиологию органов пищеварительного тракта из тупика, в котором она пребывала долгие годы, и поднять эту науку на небывалую высоту. Основным инструментом его исследования стал тончайший, виртуозный эксперимент. Он придумал и осуществил целую серию остроумных, утонченных хирургических операций. Так, например, для детального изучения работы желудочных желез Павлов разработал и впервые провел операцию образования так называемого «маленького желудка». Суть ее заключалась в том, что из части желудка собаки выкраивался небольшой изолированный мешочек. Пища в него попасть не могла, и маленький желудок мог служить зеркалом всех химических процессов, происходящих в большом желудке. Благодаря фистуле в его полости экспериментатор имел возможность наблюдать, как меняется состав желудочного сока в зависимости от поступающей пищи. Своеобразными «окошками», через которые можно было наблюдать работу различных органов пищеварительного тракта, стали для Павлова фистулы, которые он научился выводить из самых разных мест — из пищевода, желудка, кишечника, из протоки поджелудочной железы, из каналов слюнных желез и т. п. Все это позволяло ему по желанию изолировать интересующие его органы от остальных частей пищеварительного тракта, наблюдать и исследовать их работу независимо друг от друга. Одна группа исследователей была приставлена к желудку, другая — к поджелудочной железе, третья — к кишечному каналу. Отсчитывались капли слюны, желудочного и кишечного сока, а также желчи, изучался их химический состав и его изменение в зависимости от характера и количества пищи. За несколько лет был накоплен уникальный материал, позволивший ответить на множество вопросов.