Гельмгольц одним из первых измеряет скорость распространения нервного импульса, изучает процесс мышечного сокращения. Он становится первым человеком, увидевшим сетчатку глаза живого человека; для этого он использует специальное глазное зеркало — офтальмоскоп, изобретенное и сконструированное им собственноручно в 1850 г. Его обширные исследования по физиологии зрения (теория аккомодации, цветового зрения и т д ) были обобщены и систематизированы в классическом труде «Руководство по физиологической оптике», вышедшем в 1856—1857 гг.
Через 5 лет после изобретения офтальмоскопа, в 1855 г., Гельм-гольцу предлагают место профессора анатомии и физиологии в Бонне, где он приступает к работам, посвященным восприятиям «цветности» В своем «Руководстве по физиологической оптике» он доказал, что существуют три основных цвета — красный, зеленый и фиолетовый — и что из их смешения образуются все другие цвета. Таким образом, Гельмгольц дополняет и усовершенствует так называемую трехкомпонентную теорию цветового зрения, впервые предложенную Т. Юнгом.
В 1856 г. Гельмгольц решает заняться изучением акустики: исследованием комбинационных тонов начались акустические эксперименты Гельмгольца. Он строит модель уха, позволившую изучить характер воздействия звуковых волн на орган слуха, решает задачу так называемой органной трубы, разрабатывает физическую и физиологическую теорию восприятия и генерации музыкальных звуков Кроме того, он проводит важные исследования колебания струн и акустических резонаторов (резонаторов Гельмгольца), занимается гидродинамикой вихрей, разрабатывает принцип механического подобия, позволивший объяснить ряд метеорологических явлений и механизм образования морских волн.
В 1858 г. Гельмгольцу предлагают должность профессора физиологии в Гейдельберге. Этот период является наиболее блестящим и глубоким в его творчестве. Помимо работ по физике и физиологии, появляются математические исследования, ставшие самыми значительными в области математической физики с момента ее основания.
В 1871 г. Гельмгольц заведует первой физической кафедрой в Берлине. Он все больше уделяет внимания физике. Его работы по изучению электродинамических действий являются первым шагом в создании электромагнитной теории света, развитой впоследствии Максвеллом.
В работе «О статике моноциклических систем» им предпринимается попытка дать в общей форме теорию тепловых процессов, представить тепло как движение, исследуемое по принципу наименьшего действия, где заложены основания теории квантов и современного принципа относительности. Им также высказаны два положения, играющие главную роль в современной науке, указано на необходимость признания ограниченной делимости электричества, приводящей к теории электронов, и дано представление о возможности электрических колебаний, которые были позднее исследованы его знаменитым учеником Герцем.
В 1888 г. он возглавляет Физико-технической университет, где ведутся как прикладные, так и фундаментальные исследования. Под руководством Гельмгольца институт превратился в крупный научный центр, куда приезжали учиться молодые физики из многих стран, в том числе и из России.
За свою насыщенную жизнь Гельмгольцем написано более двухсот работ; без отрыва от исследовательской деятельности он активно занимался и преподавательской работой.
Вклад Гельмгольца в психологию чрезвычайно велик: кроме восприятия, он занимается, в частности, развитием концепции «бессознательных умозаключений», согласно которой актуальное восприятие определяется уже имеющимися у индивида «привычными способами», за счет которых сохраняется постоянство видимого мира и в которых существенную роль играют мышечные ощущения и движения.
Его вклад в науку того времени представляется тем более значительным, поскольку во времена Гельмгольца чувственные восприятия трактовались исключительно с теологической точки зрения — как таинственный духовный акт, заложенный творцом. Гельмгольц же неопровержимо доказывает в своих многочисленных работах, что наши ощущения имеют реальную природу.
Гельмгольцу удается описать на основе данной концепции механизмы восприятия пространства. Его теория о восприятии пространства сводилась к тому, что способность человека воспринимать пространство приобретается на основе жизненного опыта, путем сопоставления зрительных образов предметов с восприятием движений глазных мышц.